今天(2013-08-05)家衛所終於公布了台灣鼬獾身上的狂犬病毒的序列分析結果。為什麼一定要做系統發育分析(phylogenetic analysis)來能確認病毒的起源呢?
因為許多醫學檢驗所使用的核酸或蛋白質序列快速診斷分析(經常使用UPGMA或Neighbor-joining這種快速的方法)只能在樣本數很少、不牽涉病毒起源追溯、只欲初步瞭解病毒身份時使用，但其分析結果是不能被過度解讀的，也不可以拿來推測病毒起源甚至是傳播到某個地區的時間。我在先前的文章中已經說過，若要使用系統發育分析策略來探索病毒起源，那一定要把來自多個地區與多數動物的狂犬病毒序列，加上台灣的序列一起用正確的方法分析才能得到可信的結果。而這樣的結果會影響疫情來源與未來策略的判讀。
假設台灣鼬獾病毒真的直接來自中國鼬獾，那麼很可能間接證實的一個觀點，也就是真的有人莫名地帶了大量中國鼬獾進台灣，並咬了台灣的鼬獾產生大量死亡；那麼未來的管制重點就是動物走私。
但如果台灣的鼬獾病毒並非來自中國鼬獾，而是已經存在台灣一段時間的病毒株，那麼就非常可能是長期未篩檢出來，而且此病毒株的致病力與感染動物範圍是我們完全缺乏瞭解的。但如果病毒分析的取樣有偏差，資訊品質不佳呢？這就會對病毒起源與相關因素造成非常大的誤判。我們先來看看家衛所做的分析結果。
以下這個圖是家衛所使用389bp的N gene所重建的病毒系統發育關係。家衛所的公告內容只說明一些其實無法判斷起源的資訊。例如A與B差多少%，C與D差多少%。我想說的是，沒有人會直接使用樣本序列間的homology或divergence來解讀"起源"。那只是樣本的核酸序列在某種比較方法下的差異，就算要談homology或divergence，家衛所也應該要告知國人"同一種寄主身上不同的病毒株的平均遺傳差異有多少"或是"不同動物身上的病毒珠間的遺傳差異有多少"。如果沒有這樣的資訊，一再地告知媒體A與B差異多少，真的無法解讀病毒的起源。
我們需要知道的是: (1) 台灣的鼬獾病毒是否具單一起源(single origin)，如果是單一起源，表示感染源頭只有一個，若不是單一起源，那麼感染源頭可能不只一個，會比較棘手；(2) 台灣鼬獾病毒的姐妹群(sister group)是那個地區，那個動物身上的病毒？在家衛所公告的資訊中，資訊不足無法判定。各位知道為什麼嗎？(1) 家衛所認為已經把中國、美國、墨西哥與菲律賓的(少數)序列納入分析，但認為菲律賓的狂犬病毒原本就來自中國因此並不需要納入菲律賓的樣本進行分析；(2) 沒有把台灣以外樣本的來源動物與地區標示清楚，使得大眾與媒體不知道如何解讀資訊；做過分析的人都知道，把所有樣本的資訊提供完整不是基本的嗎? (3) 怎麼連外群(outgroup)都沒有標示呢？外群的選擇會直接影響內群(ingroup)的關係，這應該是要被說明白的呀。還有，N gene約有1353bp，但家衛所只做出389bp，會不會太短呢？
有研究生把序列拿去blast, 結果發現台灣東部鼬獾病毒序列居然與跟菲律賓的狗病毒最像，但是家衛所卻認為台灣與中國大陸的鼬獾病毒最像？有網友一個一個把下面的代碼打進NCBI，結果發現他們用的都是有genome的strain... 使用這樣的資訊品質居然能夠得出"台灣的病毒來自中國"的結論？
任何做過phylogenetic analysis的人都知道取樣綿密程度(taxon sampling density)與資訊完整度，會影響分析結果，家衛所這樣的結果就要拿來當防疫基礎？我會無法認同耶。
以下是使用G gene所重建的系統發育關係，和上面的分析一樣有類似的缺陷。當你的取樣只拿台灣、中國(加上很遠的美國、墨西哥)樣本做分析，那結果當然是台灣和中國的在一起，進而導出台灣鼬獾病毒來自中國鼬獾的結論。但這真的是這樣嗎？
台大王弘毅老師在8月5日重新做了分析。王老師重新下載資訊並重建病毒的演化關係。下圖收集目前全世界由犬所分離出來的，以及具有代表性的狂犬病毒株的核酸序列，還有中國大陸具有代表性的狂犬病毒，另外有中國鼬獾(ferret badger)，與台灣鼬獾的病毒序列。王老師以用狂犬病毒的nucleoprotein分析，序列全長1353bp，但因台灣序列只被定序出一部分，以pairwise-deletion的方式去除沒有重複的部分，用Kimura 2 parameter model 以neighbor-joining的方式所得(註：Neighbor-joining在某些狀況下是有缺陷的分析方式，近年論文主張使用ML與Bayesian，但做Bayesian不一定會顯示出與Neighbor-joining不一樣的樹形)。下圖的數字是以100次bootstrap(這是一種評估演化樹可信度的統計方法)評估可信度的結果。下圖以印度的狂犬病序列作外群，並根據Journal of General Virology (2008), 89, 2673–2681的分析重做。也就是說，王老師的分析包含多種動物、多個地區，並使用對的方法來重建這個關係。結果非常明顯和家衛所的完全不同！台灣鼬獾身上的狂犬病毒並非來自中國鼬獾，而是一個獨立的病毒演化支系。其姐妹群是(菲律賓的狗 + 一堆中國的狗與鼬獾的病毒)。
而台灣鼬獾身上的病毒之間的分化也很有趣，如果，這隻病毒像禽流感一樣一下子在近期侵入一下子造成鼬獾大量死亡，那從每一隻鼬獾身上獲得的病毒在序列上應該近乎一樣啊，怎麼會有相當大的分化呢？這讓我們高度懷疑這個病毒可能在台灣存在一段時間，但為什麼忽然大量造成鼬獾致死，則是應該要釐清的。(但我們不是病毒流行病學者，我們不會輕率地說這就叫本土病毒株)
所以，還要再疑神疑鬼地說中國鼬獾的走私造成台灣鼬獾的感染嗎？我認為家衛所恐怕要多做點分析把序列弄完整才行，我不認為現階段台灣的演化學界學者能接受這樣的結果，而誤導防疫的方向！然後，有政治色彩的鄉民請不要再講什麼"中國連病毒都黑心"，科學證據是不會因為政治傾向而轉彎的呀~ 狂犬病就是一個全球性的疾病，我們一定要正視人類破壞環境，使寵物與野生動物不當接觸而造成的災難啊，多一點對動物的慈悲心吧。(以下分析結果圖片由王弘毅老師提供)
我認為王老師這個分析並不宜被當成final result，因為台灣鼬獾病毒的序列尚不完整。所以這個分析可以說是"以演化生物學者的觀點重新做一個對的分析，以回應家衛所所公布的結果"，而這個結果否定了台灣鼬獾病毒來自中國鼬獾病毒的臆測。那未來可以做什麼呢? 由於家衛所目前所得到的序列還不是很完整，我想家衛所應該會繼續做下去。然後可以使用近年討論病毒起源的論文多半使用Maximum Likelihood和Bayesian coalescent approach (貝葉氏定理聯合法)兩種方法來重建親緣關係嗎？因為NJ的缺陷已經有太多論文討論過了。
然後台灣的病毒若存在台灣一段時間，那麼釐清是20年前還是50年進入台灣有意義嗎？我覺得現階段來說意義不大耶。為什麼？因為過去的狂犬病毒沒有留下遺傳資訊，而過去也沒有現在這種技術，因此目前缺乏可回應這種問題的資訊。而且我們就是知道"已經出現一陣子了，很可能不是忽然入侵的＂。現在要做的除了加強疫苗施打、野生動物疫情監測、測試各類食肉目動物對這隻病毒的感染程度、瞭解鼬獾的發病狀況，以及相關SOP的訂定與演練外，就是落實寵物登記與禁絕家庭寵物進入淺山郊野吧。
然後台灣的病毒若存在台灣一段時間，那麼釐清是20年前還是50年進入台灣有意義嗎？我覺得現階段來說意義不大耶。為什麼？因為過去的狂犬病毒沒有留下遺傳資訊，而過去也沒有現在這種技術，因此目前缺乏可回應這種問題的資訊。而且我們就是知道"已經出現一陣子了，很可能不是忽然入侵的＂。現在要做的除了加強疫苗施打、野生動物疫情監測、測試各類食肉目動物對這隻病毒的感染程度、瞭解鼬獾的發病狀況，以及相關SOP的訂定與演練外，就是落實寵物登記與禁絕家庭寵物進入淺山郊野吧。
